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技術支持

大鼠大腦中動脈阻斷實驗(MCAO模型)的經驗

時間:2015-08-31來源:本站作者:玉研儀器

  實驗前準備

  麻醉劑:水合氯醛(應較好的控制大鼠體溫)

  保溫:60W白炙燈高度為37cm直接照射能使肛溫保持在 37℃

  栓線的制備:1.取熔點為56℃的固體石蠟一塊,在瓷杯中加熱熔化。直徑為o.24mm、長5cm的魚線一端5mm長的一段,垂直在熔化的石蠟中迅速浸入并提起,立即凝固的一薄層石蠟可牢固地粘附在魚線一端的表面,其直徑為0.26mm。就這樣,普通的魚線即可變成規相一致頭端光滑圓鈍的栓線。

  2.在魚線18mm的位置用涂改液標記一個白色點。

  TTC的配制:用0.2mol/L磷酸緩沖液(PBS)配成2%TTC溶液(pH7.5),避光保存。

  體重與栓線直徑: 線栓直徑0.24mm采用的SD大鼠,體重250-300g。

  實驗方法:

  動物用10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定,頸正中線切口,沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜,分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA),在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA,然后近心端結扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm處剪一小口,將拴線插入到ICA,這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。(不可過緊,否則近線困難,但松了又會出血。)用眼科鑷輕推拴線,從血管分叉處開始算距離,當插入深度在18 mm時(一定要將血管放松至原來狀態, 且保證標記點在分叉處,由于標記的是白色的所以很容易看的),緊緊系牢CCA遠心端的細線,此時的關鍵是動作輕柔,不要使ICA有任何的牽拉,否則栓線會脫出ACA,可能會造成缺血失敗。血管外的栓線不要留得過長,更不要縫在皮外,大鼠醒來后會自己拔出??p合傷口,單籠飼養觀察。如果需要再灌的話,就把拴線抽出即可,因為腦底有個動脈環,結扎一側頸總動脈大腦不會缺血的。

  注意事項:

  1.分離時要層次清楚:正中剪開SD大鼠頸部皮膚,分離皮下結締組織時會發現該組織與頸部兩側鼓泡腺體(很多人誤認為那是甲狀腺)結合緊密,因此不必分離過于太細,直接在正中兩側鼓泡腺體之間分離,這樣能不接觸胸鎖乳突肌而直接暴露頸前頸群且不會損傷腺體造成過多出血。下一步是分開頸前肌群,這時候要注意用小鉗子作撐開分離動作要在左右肌肉塊之間而不是一塊肌肉的肌纖維之間,雖然它們看起來很模糊,但這樣能保證不會出現較多條索狀細肌纖維條影響下一步頸內動脈的尋找與分離,并且能整塊地向一側牽開頸前肌群暴露頸動脈鞘。見到頸動脈鞘了則要注意細致分離迷走神經,若損傷則可能影響其呼吸而死亡的。

  2.分離血管時,要盡量將血管剝離的干凈些,這樣在用眼科剪剪口時就不會誤剪外膜(誤剪的話再剪就很容易把口剪大了或者剪斷了,要注意口子越小越好插線),且要剪一個斜行的切口(眼科剪與血管約成45度),這樣在血液剛流出時仍能看上翻的斷口管壁,這樣即容易插入栓線且血管受得了插線時一定的牽拉。當然,切勿牽拉過猛,以免使血管發生痙攣,導致栓線不能順利進入。

  3.注意盡量不要損傷在頸內頸外分叉下的交感神經節。

  4. 如果你用的是中長效麻醉劑,插線成功后,固定絲線,然后讓其俯臥位,而且稍稍抬高其頸部,才能確保模型成功。

  5. 栓線進入后頸內動脈后即可逐漸插入了,有時候很順利一插到底,但有時候在中間就怎么也進不去了,這是因為在血管入顱穿過顱骨時有一個狹窄或者角度。因此,碰上這種明顯阻力時,一定不能盲目向前使力插,越插栓線前端變形越進不去且容易損傷血管。這時候正確的作法是往外抽出較多栓線,也許會有一定的動脈血流出,不必慌,只要順著血管走行調整一下進線角度輕柔的使勁,一般都能進去,反復試幾次還不行最好換根栓線,很可能前端也經變形角度變了!頸內動脈的走向為內上方,可以用眼科鑷夾住魚線插,但進去后要注意,別太用力,要不血管就要破了

  6. 栓線不能在血管里反復進退,否則及容易造成蛛網膜下腔出血,,而且很容易誤解為模型成功,因為這時的神經功能改變也很明顯,但并不是由于栓塞引起的

  7. 進線時,使栓線有一定程度的彎曲,且只要保證栓線向屋頂方向彎曲,一般都能將線插如顱內,決不會進入翼腭A。

  8. 術后一定要注意保暖。

  9. 插入線拴要輕柔熟練,速度盡可能快,以避免時間長了血管內血栓形成。

  10.手術后評分的主觀因素很大,有用5分制和11分制的,我個人認為用5分制比較準些。

  舍去標準:

 ?、潘ň€插入深度不足18 mm,且無明顯神經功能缺損表現或癥狀很輕的大鼠

 ?、? 蛛網膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis環動脈有凝血塊的大鼠,因為這是出血性腦損傷或永久性腦缺血損傷,而非MCAO/Reperfusion損傷。

  3)手術時出血較多,癥狀很重的動物。

  死亡原因分析:

  首先要找出死亡原因,解剖死亡大鼠的腦,先看是否有蛛網膜下腔出血,如有出血,表明死因是插線太深,以后注意插線深度;如無出血,則還要再看是否有嚴重的半球水腫,如水腫嚴重,則表明死因是腦缺血時間太重,需要縮短缺血時間;如既無出血,又無明顯的腦水腫,那就要注意動物狀態或生活環境是否太差。

  附帶的其他說明:

  1..線拴法存在一定的死亡率。對于這情況我感覺比較頭疼,也希望高手指點。

  2. 模型成功率和評價指標是相關聯的矛盾,手術后可根據動物的表現加以評分,確定模型是否成功,模型成功與否會對結果的評價帶來影響。有可能你模型沒成功,結果判斷為是藥物的作用效果。所以對手術后模型是否成功應該進行篩選的。另一方面,如果你做了預防給藥,藥效的作用也容易被認為是模型不成功,這也需要后邊進行腦組織染色和組織血檢查進行驗證。腦組織檢查時可剔除模型不成功以及SAH的個例。

  故實驗在手術后要進行行為學評分,試驗結束時應對腦組織進行組織學檢查或染色。TTC染色是采用的宏觀標本染色,確定梗死面積可采用體積法或面積法,但最好用掃描儀將腦組織切片進行掃描,選擇合適的軟件統計梗死面積。

  3.大鼠大腦中動脈永久性閉塞性腦缺血模型,梗死體積出現的最小時間點可能為2h,體積隨時間進行性增大,至12h基本趨于穩定

  4. 整個試驗是很費動物的,存在15-30%的淘汰率(如果你做的好),但注意嚴格控制自己淘汰的動物(紀錄具體情況)。

  5. 除了剛才說的蛛網膜下腔出血外,還有一些老鼠肺出血明顯,整個肺暗紅,我也想不出原因,不知道是不是醫學臨床所說的腦肺綜合癥.

  6.在頸內和頸外之間常常會有一個交通支,其位置也不太相同,一定要萬分小心,我曾經因為不知有這個交通支而勿將其破壞,導致大鼠出血不止!

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